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          干貨分享!細胞劃痕實驗詳解
          koster / 2020-06-28

          細胞遷移在許多復雜的生理和病理過程中起著重要作用。傷口愈合測定是研究體外細胞遷移的簡單方法。該測定基于以下觀察:當在匯合細胞單層上產生人工間隙時,所產生的間隙邊緣上的細胞將遷移直至建立新的細胞。ibidi Culture-Insert 系列為傷口愈合實驗提供了完整的解決方案,從樣品制備到圖像分析只需要幾個步驟。

          本應用簡報是使用 ibidiCulture-Insert 2 Well 分析 MCF-7 細胞遷移行為的詳細方案。

          圖 1   使用 ibidi Culture-Insert 2 Well 進行傷口愈合測定的實驗工作流程

          ibidi Culture-Insert 2 Well 放置在細胞培養表面上,提供兩個細胞培養容器,每個容器由 500μm 壁隔開。在兩個儲庫中填充細胞懸浮液僅允許細胞在指定區域生長。移除培養插入物 2 在適當的細胞附著后,產生大約 500μm 的無細胞間隙。顯微鏡用于評估傷口愈合過程。根據您感興趣的焦點,可以通過使用視頻顯微鏡或通過在不同時間點觀察圖像來完成。測量細胞覆蓋區域的變化允許量化傷口閉合的速度并提供細胞遷移特征。

          實驗工作流程也可以應用于 Culture-Insert 3 Well 和 Culture-Insert 4 Well。他們的區別是更多的孔和相應的更高數量的無細胞間隙。

          1.  材料

          • 細胞:                              MCF-7 (ATCC: HTB-22; DSMZ:ACC115)
          • 同一實驗軟件:                   2 孔插件放在 35 毫米的培養皿中,高壁(ibidi,80206)
          • 細胞培養表面:                 ibidi ibitreat
          • 細胞培養基:                    RPMI (西格瑪,R8758) = 10% FCS (西格瑪,  F0804)
          • 細胞解離溶液:                 胰蛋白酶-ETDA(Sigma,59418C)
          • 無菌鑷子
          • 倒置顯微鏡,最好具有自動圖像采集系統和用于活細胞成像的階段頂部培養箱


          實驗工作流程
          步驟 1:細胞接種

          為了建立可靠的數據采集系統,您必須在開始實驗之前定義實驗參數。這包括例如選擇正確的細胞接種密度。我們建議使用 24 小時后產生 100% 光學匯合細胞層的密度。

          1. 像往常一樣準備細胞懸液。建議包括離心步驟以去除死細胞和細胞碎片。將細胞懸液調節至合適細胞濃度。在 24 小時后獲得 3×105 細胞/ ml以獲得匯合的細胞層。

          2. 將 70μl 細胞懸浮液應用于 Culture-Insert2 孔的每個孔中。避免搖動 μ-Dish,因為這會導致細胞分布不均勻。

          3. 將細胞在 37°C 和 5%CO2 下孵育至少 24 小時



          圖 2   在 ibidi Culture-Insert 2 Well 中接種細胞

          第 2 步:間隙形成

          匯合細胞層是開始該測定的先決條件。去除 Culture-Insert 2 孔后加入新鮮培養基。如有必要,補充培養基中的抑制或增強物質,以評估其對細胞遷移行為的影響。

          1. 在顯微鏡下 24 小時后檢查細胞密度。如果在 24 小時后沒有達到匯合的細胞層,則將 μ-Dish 再次置于細胞培養箱中 12-24 小時,定期檢查匯合點。

          2. 用無菌鑷子輕輕取出 Culture-Insert 2 孔。如圖 3 所示,刪除 Insert 一角


          圖 3   使用無菌鑷子去除 ibidi Culture-Insert 2 孔

          3. 移除插入后,檢查您的細胞層是否仍附著在 μ-Dish 的表面上。

          4. 用無細胞培養基或 PBS 清洗細胞層,去除細胞碎片和非附著細胞。

          5. 使用推薦體積為 2 ml 的無細胞培養基填充 μ-Dish


          圖 4   由 ibidi Culture-Insert 2 Well 創建的無細胞間隙

          第 3 步:獲取顯微鏡圖片

          我們建議錄制延時視頻,以確定時間依賴性和細胞遷移的特征。

          1. 將培養皿放在顯微鏡上并移動它直到你有間隙,并在圖像中捕獲兩個細胞前端。使用 4x / 5x 或 10x 物鏡。傷口區域的方向并不重要,但需要水平或垂直。

          2. 在接下來的幾個小時內多次拍攝圖像,開始觀察過程。

          3. 在 ibiTreat 表面上培養的 MCF-7 細胞的時間推移測量進行 20 小時,時間間隔為 30 分鐘。


          圖 5   使用 MCF-7 細胞的遷移測定的時間流逝測量(比例尺:200μm)

          步驟 4:使用 ACAS 和數據解釋進行定量圖像分析

          必須分析顯微照片以獲得關于培養細胞的遷移特征的信息。這可以通過使用圖像處理軟件手動完成,也可以使用自動圖像分析完成自動細胞分析系統(ACAS)由 ibidi 提供。

          使用 ACAS 分析此處顯示的示例數據。自動圖像分析檢測細胞覆蓋區域。相對于時間繪制細胞覆蓋區域顯示了間隙閉合的過程。線性相可用于表征遷移(=傷口閉合的速度)。

          線性相的斜率顯示平均刮擦閉合速度為 0.0184×106μm2/ 小時(= 0.44×106μm2/ 天)。


          圖 6   ACAS 傷口愈合實驗的定量圖像分析

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