本應用介紹了使用 ibidi μ-Slide 18 孔載玻片培養，固定和染色貼壁細胞的簡單方案。在此示例中，我們培養了人內皮細胞，用 paraformaldehyde 固定了它們，并對 F-actin 細胞骨架和表達α- 微管蛋白的微管進行了染色。細胞核用 DAPI 復染。

該應用四個主要步驟：

在本應用中，使用了以下材料：

  熒光顯微鏡（倒置），帶有合適的濾光片組

1. 播種

· 在無菌條件下打開 ibidi μ-Slide 18 孔載玻片 ibiTreat（＃81816）的包裝，并將其放在 μ-Slide 機架（ibidi＃80003）上。

· 準備細胞懸液（1 x 105 細胞/ ml），并在 μ-Slide 18 孔載玻片每個孔中加入 100 μl。

· 用提供的蓋子蓋上腔室。

· 在潮濕的細胞培養箱（37°C，5％CO2）中培養過夜。對于更長的細胞培養，我們建議幾天后進行中等程度的交換。

2. 固定，滲透和封閉

· 使用細胞培養抽吸裝置從孔中抽吸細胞培養基。

· 用 Dulbecco PBS 沖洗細胞，方法是將 100 μl 緩慢加入每個孔。

· 用約 100 μl 4％paraformaldehyde 固定細胞 20 分鐘。

· 用 PBS 沖洗細胞兩次，方法是將 100 μl 緩慢加入每個孔中。

· 除去液體，并在 PBS 中加入約 100 μl 的 0.1％Triton?X-100。孵育 10 分鐘。

· 用 PBS 洗滌細胞,緩慢將 100 μl 加入每個孔中。

· 除去液體，并在 PBS 中加入 100 μl 1％BSA 封閉溶液。孵育 20 分鐘。

· 用 PBS 洗滌細胞,緩慢將 100 μl 加入每個孔中。

3. 染色

· 準備您的染色和抗體溶液。

· 使用細胞培養抽吸裝置從孔中除去液體。

· 將 100μl 用 PBS 稀釋的一抗（抗-Tubulin 1：1000）稀釋到每個孔中，并在 4°C 下孵育過夜。

· 用 PBS 洗滌細胞一次，持續 10 分鐘。

· 將在 PBS 中稀釋的 100 μl 二級抗體混合物（抗小鼠 IgG-Atto594 1：500 和 LifeAct-TagGFP2 蛋白 30 μg / ml）稀釋到每個孔中，并在室溫下于黑暗中孵育 3 小時。

· 用 PBS 洗滌細胞兩次，每次 10 分鐘。

· 吸出 PBS，并在每個孔中加入約 100 μl 含 DAPI 的 ibidi 封固劑。使用滴管瓶滴加安裝介質。

4. 顯微鏡觀察

· 在熒光顯微鏡下用合適的濾光片組觀察細胞，并可選擇用 ibidi 浸油（＃50101）觀察細胞。

· （可選）覆蓋圖像以創建合并圖像。

5. 結果

接種在 μ-Slide 18 孔載玻片 ibiTreat 中，物鏡 60x，油浸后 24 小時后的 HUVEC（人臍靜脈內皮細胞）。

綠色：F-肌動蛋白（LifeAct-TagGFP2 蛋白）

紅色：微管蛋白（單克隆抗 α-Tubulin 抗體，小鼠+抗小鼠 IgG-Atto594）藍色：核仁（使用具有 DAPI 的 ibidi Mounting Medium 進行 DAPI 染色）

在本應用中使用的 ibidi μ-Slide 18 孔載玻片帶有 18 個孔的小室蓋玻片，用于細胞培養，免疫熒光和高端顯微鏡檢查，它具有以下特點：

• 多合一 18 孔腔載玻片，用的細胞數量少，試劑量少的經濟高效實驗
• 顯微鏡載玻片非常適合通過最高光學質量的 1.5 號聚合物蓋玻片底部進行高分辨率成像
• 適用于各種顯微鏡技術（例如 DIC，寬場熒光，共聚焦顯微鏡，雙光子顯微鏡，FRAP，FRET，FLIM和  LSFM）的細胞培養室