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          LED光源-從顯微成像到光遺傳學研究
          koster / 2019-08-13

          生物學研究中的LED

          從顯微成像到光遺傳學

          由于LED被引入生物科學研究的顯微鏡照明,使研究小組和影像實驗室有信心將其范圍和潛力完全取代金屬鹵化物光源,合適的HBO弧光燈替代品一直是一個挑戰。但隨著最近推出的全光譜照明裝置和更先進的系統,LED照明正在成為新的標準。

          顯微鏡長期以來一直在生物科學研究中占據重要位置,可追溯到第一次觀察
          活細胞包括使用LED的技術已經開發 - 并且將繼續 - 以滿足研究人員新的和不斷變化的需求。

          生物科學顯微鏡
          生物科學微拷貝中使用的技術可分為兩個主要陣營:
          • 透射光,明視場顯微鏡,用于可視化染色的組織學樣本或采用對比度方法,如相位對比度,微分干涉對比度和浮雕對比度;
          • 反射光熒光顯微鏡


          1a,1b。明場顯微鏡圖像描繪了染色載玻片(a)和遷移室(b)中細胞的相襯圖像。
          為了篩選染色組織(圖1a)或對比技術,如相(圖1b)或DIC,典型的研究實驗室將使用配備12 V白熾鎢鹵燈(100 W)的顯微鏡設置為9 V,色溫約為3200 K.雖然這是一種廉價而有效的設置,但LED光源正成為主要顯微鏡制造商的默認透射光源。LED具有與日光濾光器類似的顯色指數,可提供出色的靈活性并集成到硬件和軟件中。
          LED照明已經成為明場顯微鏡的一種選擇,但它在熒光顯微鏡領域卻是如此

          已經產生了最大的影響。直到最近十年,高壓汞蒸氣電弧放電燈才是氙氣標準配置工作的替代品。大約在這個時候,LED成為熒光顯微鏡的一個選擇。LED克服了很多
          與弧光燈相關的問題,包括燈泡的重復更換和隨后的對準,重啟時間,啟動后強度的波動以及隨時間的強度下降。
          克服汞和氙系統失效的能力并非如此
          最初由LED制造商實現。對于需要單色或雙色系統的研究人員而言,LED立即適用。然而,主流市場需要的是適合標準范圍的熒光團(DAPI,FITC,TRITC,Cy5)的光源,以及使用Cy5.5,Cy7,CFP,YFP等的靈活性。終端LED系統有四個“固定”通道,確實找到了自己的位置,但沒有達到預期的效果。
          一般光源的作用由金屬鹵化物光源填充。鹵化物燈泡持續了2000小時,重要的是它們比四通道LED裝置提供更大的靈活性。鹵化物源也有一些缺點。燈泡在顯微鏡開啟的持續時間內點亮,而LED僅在短暫的采集期間點亮。一些鹵化物光源的波動系數可以達到10%。


          2a,2b。與汞或鹵化物光源相比,基于LED的光源的強度具有更好的壽命和強度穩定性(a)。光譜范圍涵蓋大多數技術中使用的大多數熒光團的峰值激發
          鹵化物光源本質上將UVIR投射到光導上。由于UVIR的降解,鹵化物系統中的光導管需要在一段時間后更換。但LED對光導的危害較小,消除了任何退化。
          為了產生影響,LED制造商需要一種能夠在365700納米及更長時間內提供光譜照射的系統。通過組合多個波長生產有效的白光源,可直接替代用戶現有的顯微鏡系統和濾光片立方體。這些還提供了額外的優勢
          0100%的強度調整,隨時間穩定的強度(圖2a2b),即時開/關和集成到軟件中的機會。
          白光LED照明系統應被視為金屬鹵化物和汞的經濟有效替代品。
          如上所述,主要制造商最初為更高級的例程構建了四色LED光源,包括多色,延時成像。與傳統光源相比,它們具有許多優點,例如強度穩定性和速度。
          在帶有內部快門的標準延時顯微鏡系統中,快門將被打開,相機曝光被接合,然后每張照片的快門關閉。這仍然會使樣品暴露在來自弧光燈的光下,使相機獲取時間增加一倍,并可能導致光毒性和實驗失敗。
          在實驗中,始終建議從樣本中的多個站點拍攝圖像。這確保了圖像作為整體代表樣本。在某些情況下,很難訪問統計所需的點數
          實驗方案中循環時間內的顯著性。即使在簡單的情況下,研究人員使用電動顯微鏡并自動更換旋轉木馬中的過濾器,顏色之間的切換時間可以在500800毫秒之間,慢快門時間為200毫秒。為克服這一缺陷,一些顯微鏡制造商采用先進的弧光照明系統
          快速內部快門(1 ms),以及相鄰位置之間50 ms延遲的快速濾光輪和衰減器。但是,連續激活這些組件仍會增加時間開銷并導致圖像捕獲速度變慢。為了加快成像速度,一些公司采用實時控制器來并行更換組件;這些系統增加的復雜性和成本使它們超出了標準研究實驗室的范圍。最初的四通道LED單元獲得了成功
          發光二極管


          平面是幾微米,使得這樣小的焦平面易受焦點漂移的影響,這通常是由熱膨脹和收縮引起的。
          為了克服熱漂移的挑戰,有兩種常見的方法:基于軟件的算法和基于硬件的z校正。只要細胞被限制在相似的圖像平面,軟件程序就可以充分地保持焦點,但是可以被自由浮動的非粘附細胞混淆。在硬件漂移校正系統中,光沿物鏡向后反射到檢測器,實時監測并傳遞到顯微鏡Z驅動器中。無論細胞環境如何,這都將保持所需的焦點位置,并且對于諸如粘著斑形成或新的超分辨率技術(即PALM,STORMGSD)的許多研究項目而言是至關重要的。

          使用LED照明的先進技
          有一系列新興技術傳統上采用激光照射樣品,但現在轉向LED。一個例子是結構照明顯微鏡(SIM),一種寬視場技術,可以將衍射極限以外的橫向分辨率提高一倍。這是通過將一系列圖案順序投影到樣品上并捕獲圖像,然后進行后處理來實現的。用于產生圖案的快速LED顏色切換和DMD(可變形鏡裝置)意味著與傳統的結構化圖案生成的機械方法相比可以實現高速。
          直到最近,旋轉盤共焦顯微鏡系統的特點是激光器


          在這些情況下取得了一些成功
          沒有必要將硬件快門,衰減器輪或濾光輪用于配備多波段二向色鏡的顯微鏡。單個LED可以通過TTL觸發在<1 ms內以所需強度打開,從而顯著提高速度。
          例如,當在裝有弧光燈的電動顯微鏡中以50ms的相機曝光時間成像三種顏色時,每個位置的時間是
          23秒,取決于組件的速度。對于配備多波段二向色的LED和顯微鏡,循環時間為151 ms。雖然高速系統速度更快,但LED可以顯著超越它們。吸收的主要障礙是四線系統的相對不靈活性?,F在,最新一代LED系統克服了這些問題,因為它們配備了多達16個波長(圖3a3b),跨越365nm770nm,能夠觸發適合市場上主要四頻濾波器立方體的LED組合。
          它們現在已成為普通高速,延時成像以及下面提到的一些先進技術的照明系統。

          焦點漂移校正
          LED不僅用于在延時顯微鏡中照射樣品。它們也用于大多數焦點漂移校正系統(來自制造商等)
          如徠卡,尼康和蔡司),這是用于保持焦點的反饋設備。
          在高倍率下,焦點對準
          由于通過系統的光損失而發光。然而,現在LED更強大,它們被用在一些較便宜的系統中。
          對于允許更多光傳輸的光盤,LED特別成功。LED已成為更便宜的替代方案的其他方法是TIRF顯微鏡,光動力療法(其中光用于減少腫瘤),FRET(福斯特共振能量轉移)用于確定蛋白質 - 蛋白質相互作用和鈣成像。與最快的基于短弧光柵的系統相比,用于鈣成像的LED已經變得普遍,因為其亞毫秒開關和更高的穩定性。以前,比例圖像可以10 fps成像。LED的速度增加到100 fps。


          光遺傳學
          在神經科學中,長期以來一直希望選擇性地靶向一種細胞類型進行研究而不影響樣品中的其他細胞(圖4)。部分地,這是在15年前通過使用Cre-Lox方法標記細胞來實現的,所述細胞瞬時表達已知對該細胞類型具有選擇性的基因(圖5)。然而,即使可以標記細胞類型,從單個細胞記錄的方法在技術上具有挑戰性或可能對組織有害,因此并不總是合適的。
          隨著2005年光遺傳學的發展,克服了其中一些挑戰。光遺傳學將動作電位的光學調制與選擇性靶標的遺傳方法結合起來。
          在異質群體中的單細胞類型,例如在腦組織中。它基于細菌視蛋白的修飾,細胞視蛋白是單個單元,光活化離子泵,其通過病毒載體選擇性地遞送到靶細胞中。根據所表達的離子通道,將聚焦光照射到細胞上將選擇性地激活或抑制。
          直到過去幾年,激光仍然被認為是光學刺激,因為它們的光譜線寬窄,組織中的分散度低于非相干光源。然而,LEDFWHM較窄,最近功率/光輸出增加(光纖末端100 mW / mm2,近似LED總功率的1%和LED的快速時間切換,“就光遺傳學應用而言,LED在幾乎所有方面都超過了激光器,”OpenOptogenet-ics表示(http://openoptogenetics.org/). 隨著光遺傳學協議變得更加標準化,并且在新研究實驗室的能力范圍內,LED光源也是如此對研究組來說越來越有吸引力的選擇。
          LED始終具有需要一個或兩個波長的位置,其中不需要超過四種顏色的靈活性,或者速度是關鍵因素。然而,隨著最近推出全光譜照明裝置和更先進的系統,具有多達16個波長和快速觸發,LED照明已成為新的標準。

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