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          一體化細胞免疫熒光技術介紹
          KOSTER / 2019-04-28

          一體化細胞免疫熒光技術介紹
           
          免疫熒光技術(Immunofluorescence technique)又稱熒光抗體技術,是標記免疫技術中發展最早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合,利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。
          一.傳統的免疫熒光實驗步驟
          (一)、實驗材料 
          1. 細胞樣品 
          2. 試劑、試劑盒: 多聚甲Quan;70% 甲醇;丙Tong;PBS;Triton ;BSA;DAPI 染液;DABCO;Tris;甘油   
          3. 儀器、耗材:玻片     
          (二)、實驗步驟     
          細胞爬片免疫熒光實驗步驟 
          第一天:
          1. 在培養板中將已爬好細胞的玻片用 PBS 浸洗 3 次,每次 3 min;
          2. 用 4% 的多聚甲Quan固定爬片 15 min, PBS 浸洗玻片 3 次,每次 3 min;
          3. 0.5%Triton X-100( PBS 配制 ) 室溫通透 20 min(細胞膜上表達的抗原省略此步驟);
          4. PBS 浸洗玻片 3 次,每次 3 min,吸水紙吸干 PBS,在玻片上滴加正常山羊血清,室溫封閉 30 min;
          5. 吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃ 孵育過夜;
          第二天:
          6. 加熒光二抗: PBST 浸洗爬片 3 次,每次 3 min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中 20-37℃ 孵育 1 h,PBST 浸洗切片 3 次,每次 3 min;注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。
          7. 復染核:滴加 DAPI 避光孵育 5 min,對標本進行染核,PBST 5 min×4 次洗去多余的 DAPI;
          8. 用吸水紙吸干爬片上的液體,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像

          二 傳統免疫熒光實驗主要問題

          1. 爬片效果欠佳
          2. 細胞和試劑用量大,成本高
          3. 染液分布不均
          4. 操作繁瑣,費時費力

          三. 一體化免疫熒光技術簡介 
          一體化的培養室-固定-染色-成像 免疫熒光的解決方案

          技術特點:
          1.快速簡便的樣品制備,一體化培養室簡化了免疫熒光染色方案
          2.均勻細胞分布,通道載玻片幾何結構可以產生均勻的細胞分布
          3.經濟實惠的實驗方案,需要少量的細胞和試劑
          4.高分辨率成像,適用于寬場熒光,共焦成像,FRAP-FRET-FLIM和高質量的相差成像(Phase Contrast)
           
          主要工作模式:
          1. 
          通道模式:ibidi通道載玻片是使用少量試劑的理想選擇。μ-Slides VI0.4是一般免疫熒光檢測的理想選擇,而μ-Slide I0.4Luer可在低密度培養和流動實驗中進行免疫熒光染色。

          2.開放腔室模式
          Ibidi μ-Slide 8 孔和μ-Dish35mm 能夠在全內腔中實現標準免疫熒光方案,無蓋玻片。染色后,使用高分辨率顯微鏡通過聚合物蓋玻片底部觀察樣品。

           

          3. 可拆卸腔室載玻片模式
          帶有腔室的可拆卸硅墊片為個體細胞培養和孵育提供了理想的模式。ibidi micro-Insert 4 Well可以使用極低的試劑量??刹鹦?Well|8Well|12 Well Chambers是長期樣品儲存的理想選擇。

          1. 一體化免疫熒光技術應用舉例
          超過800篇參考文獻證明了使用ibidi產品進行免疫熒光檢測的優勢。

          1. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) cultured under flow conditions in μ-Slide I 0.4 Luer

          藍色: nucleus (DAPI)
          綠色: VE-cadherins (Alexa 488 conjugated antibody)
          紅色: actin cytoskeleton (Cy5 conjugated antibody)


          2. Cell line Madin-Darby canine kidney (MDCK) cultured in μ-Slide VI 0.4

          藍色: nucleus (DAPI)
          綠色: actin cytoskeleton (Alexa 488 conjugated antibody)
          紅色: mitochondria (MitoTracker)

          3. Differentiated mouse fibroblasts cultured on elastic surface (ESS 28 kPa)

          綠色: zyxin (Alexa 488 conjugated antibody)
          紅色: alpha-smooth muscle actin (Cy5 conjugated antibody)


          產品技術參數表



          五. 總結和評價
          (1)這種腔式載玻片/培養皿,不需要包被,不需要爬片,培養細胞-沖洗玻片-固定細胞-染色-成像,所有步驟都在這個  載玻片就可以完成,直接鏡檢成像效果良好;
          (2)如果希望做完實驗還可以封片永久保存的,有這種可移除的腔式載玻片,3孔8孔12孔,根據實驗需要選擇,種好細胞染色之后,就可以撕掉框架,直接觀察或者封片保存;
           (3)如果實驗希望做小容量的,這種通道載玻片,跟普通免疫熒光實驗對比,用槍加液和吸液就可以完成所有免疫熒光步驟,操作更簡單;節省細胞節省試劑,一個通道只需要25微升液體;保證細胞分布均勻,得到更好的觀察結果;
          (4)如果實驗需要做大容量的,或者做長時間的活細胞觀察的,IBIDI培養皿,底部比普通載玻片的成像效果要好,可以直接完成所有細胞操作和觀察,這個有配套的蓋子可以減少污染,杜絕蒸發,蓋子可鎖可不鎖,鎖上的話,蒸發率基本為零,適合長時間觀察細胞;
          (5)如果實驗需要定期觀察同一個細胞/重新找回某一個之前觀察過的細胞,或計數細胞,有帶計數格的培養皿和腔式載玻片(8孔的),只要記住細胞的坐標,每次都可以輕松找回同一個細胞,不像平常用記號筆標記的那么不準確,記號筆的痕跡還會影響觀察;
          (6)如果實驗要做高通量的免疫熒光,比如藥篩,有24孔板,96孔板,384孔,價格和市面的多孔板差不多,多孔板不需要包被,也不會有自發熒光,孔壁是黑色的,所以孔和孔之間的免疫熒光不會互相影響;
          (7)這些耗材專門為共聚焦超分辨顯微成像設計,效果很好;
          (8)這些產品都是通過ibidi的專利物理方法ibiditreat處理,底部都是超薄親水的,大多數種類細胞都可以直接貼壁生長的,不需要另外包被了;如果有特殊實驗需求,可以自己再包被的(選擇uncoated版本);




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